团队首先通过染色质相关蛋白纯化联合高分辨质谱分析的方法，筛选鉴定出HSF5是一个生精细胞染色质相关蛋白。荧光共定位实验进一步确认了HSF5在生精细胞特异性核定位模式，其表达始于早期至中期粗线期精母细胞，并持续到圆形精子step4左右消失，这提示HSF5在减数分裂过程中可能发挥重要作用。

利用CRISPR-Cas9技术，研究团队构建了Hsf5基因敲除（Hsf5KO）小鼠模型。观察显示，Hsf5KO成年小鼠显现雄性不育，睾丸组织的形态学分析发现附睾中精子缺乏，睾丸管腔内圆形精子及长形精子几乎完全消失，且伴随大量生精细胞凋亡。进一步的染色体铺展实验表明，Hsf5KO小鼠的精子发生主要停滞在中晚期pachynema阶段，并且在这些停滞的精母细胞中，DNA双链断裂（DSB）修复、联会重组和减数分裂性染色体沉默（MSCI）等生物学事件没有明显异常。这些结果提示HSF5可能参与了粗线期进程后期的生物学事件，而不是在早期的DSB修复、联会重组和MSCI过程中发挥作用。

为了进一步探索HSF5基因在粗线期中晚期进程中的作用，研究团队利用单细胞测序（scRNA-seq）和Cleavage Under Target & Tagmentation（CUT&Tag）测序进行了多组学联合分析。单细胞测序结果显示，Hsf5KO精母细胞停滞在“pachytene-like（P-like）”状态，其转录谱与野生型小鼠粗线期精母细胞相比显现出显著异常，尤其是如Wee1、Dmc1和Msh5等粗线期细胞检查点基因的高表达可能导致了精母细胞的凋亡。

结合CUT&Tag的数据，研究表明，受HSF5直接靶向调控的基因如Sycp1、Meiob、Msh4等也显示出异常高表达情况。通过RNA转录动力学分析发现，野生型小鼠粗线期精母细胞在进程中，其Sycp1、Meiob、Msh4基因转录呈现逐渐降低的趋势，但在Hsf5KO情况下，这些基因的转录持续在高水平且未出现降低趋势。此外，HSF5可能通过与SMARCA5、SMARCA4及SMARCE1等染色质重构复合体蛋白相互作用，调控Sycp1、Meiob、Msh4等基因的表达，确保pachynema阶段顺利进行，从而为随后进入减数分裂解联会阶段做好准备。

综上所述，该研究揭示了HSF5在精母细胞减数分裂pachynema进程中的调控机制，为雄性不育提供了新的分子模型。在减数分裂过程中，HSF5通过与SMARCA5、SMARCA4和SMARCE1相互作用，抑制部分基因（如sycp1、Meiob、Msh4和Hat1）的表达；而在pachynema进程的后期，HSF5则直接或间接促进Hspa2、Ccnb1和Plk1等基因的表达。HSF5介导的基因调控确保了精母细胞减数分裂pachynema进程的顺利进行，并为后续的解联会奠定了基础。

本研究由浙江大学医学院附属邵逸夫医院的博士研究生罗春海和硕士研究生徐浩然、刘达琳，以及技术员余梓棋共同完成，孙斐教授和占军锋博士为通讯作者。研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金和中国博士后创新人才支持计划等项目的资助。

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