通过体外转录（IVT）获得的mRNA反应混合物不仅包含目标mRNA产物，还含有多种杂质，例如T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、NTP、模板DNA、盐离子及IVT过程中生成的mRNA副产物（如dsRNA和截断RNA片段）。这些杂质可能对mRNA的功能产生负面影响，影响其定量准确性、降低翻译效率或改变免疫原性。因此，有必要通过有效的纯化技术将目标mRNA从IVT混合物中分离出来，以确保其纯度和完整性，从而保证产品的安全性和有效性。

常见的mRNA纯化方法包括氯化锂（LiCl）沉淀、硫酸铵沉淀、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化及层析纯化等。沉淀法、磁珠法和硅胶柱法操作简单迅速，但由于其处理量小和纯化效率有限，通常适用于研究和早期应用。而在工业化生产中，层析纯化技术是主要的方法。

在2024年1月，中科院过程工程研究所的张松平团队探索了硫酸铵沉淀法提取mRNA的可行性。研究发现，当硫酸铵浓度达到18M时，增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码的mRNA沉淀率超过95%，而进一步升高硫酸铵浓度对沉淀速率的影响并不显著。此外，溶解率也是影响mRNA最终回收率的重要因素。研究表明，在室温下，当硫酸铵浓度高于18M时，沉淀物可在3分钟内迅速溶解在不含RNase的水中，溶解率超过90%。最优沉淀条件为2M硫酸铵（pH 7.0，温度20℃，沉淀时间2小时），此条件下可实现近100%的沉淀率和溶出率。

在硫酸铵和LiCl沉淀法对NTP和DNA模板的去除效率方面，硫酸铵和LiCl法的去除率均超过99%，其中DNA模板的去除率分别为82%和85%。但硫酸铵法在去除T7 RNA聚合酶方面略逊于LiCl法。硫酸铵法的优点是可以在室温下操作，这为工业生产提供了便利。

硅胶柱膜纯化主要依赖于硅胶膜表面硅醇基团与mRNA分子的相互作用。硅胶膜在高盐环境中形成阳离子桥，能够有效促进mRNA的结合，而在低盐或水溶液状态下则会释放mRNA。此外，硅胶膜对其他杂质如蛋白质和多糖的吸附较少，从而使它们在离心过程中被甩出，实现mRNA与杂质的有效分离。

在工业级别纯化中，层析法通常是首选，以获得更高质的核酸和产量。mRNA的纯化主要通过Oligo(dT)亲和色谱进行，但由于无法区分带有Poly(A)尾的ssRNA和杂质，如dsRNA，故通常需要结合疏水层析或阴离子层析进行精纯化。这种方法适用于mRNA的大规模生产，并且具备很好的灵活性。

在mRNA纯化工艺的开发过程中，样本的盐离子浓度、pH值、温度和缓冲液的选择都会影响最终的纯化效果。此外，疏水层析利用mRNA与其他杂质的疏水性能差异进行有效分离，阳离子交换层析也根据目标mRNA和杂质之间的电荷差异进行纯化。

在工业化的mRNA纯化工艺中，通常会包括一个TFF1-层析-TFF2的流程，TFF1步骤用于去除蛋白质、DNA模板及其他杂质，层析步骤则主要用于捕获mRNA并去除dsRNA等杂质。TFF2步骤则是将目标产物转移到最终制剂的缓冲液中。在高质量的IVT产物中，添加蛋白酶K进行下游纯化的工艺被证明能够有效去除核酸结合的蛋白质杂质，且其使用的TFF工艺能够顺利去除蛋白酶K及其他杂质，大幅降低成本。

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